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第一章 研究用显微镜技术1

1.1研究用显微镜的结构原理1

1.2研究用显微镜的光学系统2

1.2.1显微镜的基本光学参数2

1.2.2光学透镜的象差3

1.2.3显微镜的光学系统4

1.3研究用显微镜的种类6

1.3.1明视场显微镜6

1.3.2暗视场显微镜6

1.3.3相差显微镜7

1.3.4微分干涉差显微镜8

1.3.5偏光显微镜10

1.3.6荧光显微镜11

1.4实验12

1.4.1明视场显微镜的观察方法12

1.4.2相差显微镜的观察方法13

1.4.3荧光显微镜的观察方法14

1.4.4 DNA的光学显微镜结构观察14

1.4.5淀粉粒的偏光显微镜观察15

1.4.6显微摄影技术16

1.4.7显微照片的半自动定量分析17

思考题17

参考文献18

第二章 电子显微术19

2.1透射电子显微镜19

2.1.1分辨能力和放大倍数19

2.1.2电子束及其形成21

2.1.3磁透镜22

2.1.4图像的反差形成原理26

2.1.5透射电子显微镜的仪器结构27

2.1.6透射电子显微镜的使用操作30

2.2扫描电子显微镜34

2.2.1电子与样品的相互作用34

2.2.2扫描电子显微镜的成像原理36

2.2.3扫描电子显微镜的仪器结构37

2.2.4扫描电子显微镜的使用操作38

2.3 X射线微区分析39

2.3.1 X射线的产生及其特性40

2.3.2 X射线的检测41

2.3.3 X射线微区分析的工作方法45

2.3.4 X射线微区分析在生物学中的应用46

2.4扫描隧道显微镜47

2.4.1工作原理47

2.4.2在生命科学中的应用47

2.5电子显微术在生命科学中的应用实例49

2.5.1用透射电镜观察超薄切片49

2.5.2不使用超薄切片的电镜技术49

2.5.3扫描电镜的应用49

思考题50

参考文献50

附录50

第三章 超显微结构制样技术52

3.1超薄切片技术52

3.1.1取材53

3.1.2固定54

3.1.3漂洗与脱水59

3.1.4渗透、包埋与聚合60

3.1.5超薄切片63

3.1.6超薄切片的染色65

3.2实验67

3.2.1 Formvar支持膜的制备67

3.2.2动物样品包埋块的制备68

3.2.3植物样品包埋块的制备69

3.2.4超薄切片71

3.2.5超薄切片的染色73

3.2.6半薄切片的染色75

3.3负染色技术77

3.3.1常用的负染色液77

3.3.2染色方法78

3.3.3负染色应注意的问题78

3.4分子生物学电镜制样技术80

3.4.1核酸大分子电镜制样技术80

3.4.2蛋白质大分子电镜制样技术85

3.4.3多糖大分子电镜制样技术86

3.5电子显微镜细胞化学技术87

3.5.1基本原理87

3.5.2三磷酸腺苷酶（ATPase）88

3.5.3酸性磷酸酶（ACP）89

3.5.4碱性磷酸酶（ALP）90

3.5.5琥珀酸脱氢酶（SDH）91

3.5.6葡萄糖-6-磷酸酶93

3.5.7髓过氧化物酶94

3.6电镜放射自显影技术95

3.6.1原理95

3.6.2材料与仪器设备97

3.6.3实验步骤97

3.7冷冻复型技术101

3.7.1原理101

3.7.2仪器设备及药品102

3.7.3实验步骤103

3.7.4冷冻蚀刻复型图像的辨认106

3.8免疫电镜胶体金标记法107

3.8.1基本原理107

3.8.2实验程序108

3.8.3电镜水平的免疫染色111

3.9核酸分子杂交技术115

3.9.1基本原理115

3.9.2试剂和器具116

3.9.3 rDNA探针的制备和标记116

3.9.4原位杂交及杂交子的检测118

3.10扫描电镜样品制备技术119

3.10.1基本原理119

3.10.2扫描电镜的活体样品制备120

3.10.3孢子、花粉等少水样品的制备121

3.10.4扫描电镜一般生物样品制备方法——ODO-导电染色法121

思考题123

参考文献123

附录1仪器操作步骤124

附录2缓冲液125

附录3固定液127

附录4其它129

第四章 超离心技术130

4.1基本原理130

4.1.1离心力130

4.1.2沉降系数131

4.1.3沉降时间133

4.1.4沉降速度134

4.2离心机的种类和基本结构134

4.2.1高速离心机134

4.2.2制备性超速离心机135

4.2.3分析性超速离心机136

4.3超离心法137

4.3.1差速离心法137

4.3.2密度梯度离心法137

4.3.3等密度梯度离心法139

4.3.4密度梯度的制备和收集139

4.4超速离心在生物学中的应用142

4.4.1分子量的测定142

4.4.2未知DNA样品密度的测定142

4.4.3从密度推算DNA的G-C碱基含量143

4.4.4检测生物大分子中构象的变化143

4.5实验144

4.5.1大鼠肝线粒体的分离144

4.5.2大鼠肝细胞核的分离145

4.5.3氯化钠密度梯度纯化质粒DNA146

4.5.4氯化铯等密度梯度超离心纯化质粒DNA147

思考题150

参考文献151

附录1离心机的操作规程151

附录2 DGF-U型密度梯度形成仪操作规程153

附录3离心机转数（rpm）与相对离心力（RCF）的换算153

第五章 紫外-可见分光光度法155

5.1基本知识155

5.1.1紫外-可见光吸收光谱的本质155

5.1.2 Lambert-Beer定律156

5.1.3吸收定律的正确应用157

5.2分光光度计的一般结构160

5.3紫外-可见分光光度计的特殊装置162

5.3.1扫描装置的设计原理162

5.3.2斩波器163

5.3.3双光束分光光度计的光路设计163

5.3.4双波长分光光度计的光路设计163

5.4分光光度法164

5.4.1定性分析164

5.4.2定量分析165

5.5生物大分子的光学特性167

5.5.1蛋白质的光学特性167

5.5.2核酸的光学特性168

5.6实验168

5.6.1单色器的分光效应168

5.6.2高锰酸钾的可见光谱169

5.6.3蛋白质和DNA的紫外吸收光谱170

5.6.4蛋白质的微分光谱170

5.6.5苹果酸脱氢酶（MDH）的测定172

5.6.6不同组织苹果酸脱氢酶km值的测定173

5.6.7心肌、骨骼肌线粒体内膜ATPase的测定174

5.6.8 DNA的Tm值测定174

5.6.9 DNA中A-T碱基含量的紫外分析法175

5.6.10烟酸的光谱测定176

5.6.11豆类球蛋白的定量分析178

5.6.12豆类醇溶蛋白的定量分析179

5.6.13维生素D的测定180

5.6.14豆类种子β-胡萝卜素的测定182

思考题184

参考文献184

第六章 红外分光光度法185

6.1基本知识185

6.1.1分子的主要振动类型——伸展振动和弯曲振动185

6.1.2吸收带的位置和强度186

6.1.3吸收峰的表示方法187

6.1.4几种常用术语187

6.2基本结构187

6.2.1干涉仪原理188

6.2.2付里叶转换189

6.3红外光谱分析的试样制备方法190

6.4实验191

6.4.1试样制备技术191

6.4.2蛋白质的红外光谱分析192

6.4.3多糖分子的红外光谱分析193

6.4.4脂溶性维生素的红外光谱分析194

6.4.5毛纤维的红外光谱分析194

6.4.6红外光谱法在基因探测中的应用195

思考题196

参考文献196

附录5DX付里叶转换红外分光光度计197

第七章 荧光分光光度法201

7.1荧光分析的基本知识201

7.1.1荧光的产生201

7.1.2荧光量子产率201

7.1.3荧光强度202

7.1.4荧光偏振202

7.1.5相对荧光量子效率202

7.2荧光分光光度计的基本结构204

7.3荧光分析的影响因素及注意事项204

7.3.1温度对荧光的影响204

7.3.2 pH的影响204

7.3.3溶剂的影响204

7.3.4荧光的消退204

7.3.5防止污染204

7.4生物样品的荧光分析204

7.4.1维生素B1的测定206

7.4.2维生素B2的测定208

7.4.3维生素C的测定209

7.4.4维生素E的测定211

7.4.5微量元素硒的测定213

7.4.6蛋白质的测定215

7.4.7肌肉中乳酸脱氢酶的测定216

7.4.8毫微克DNA的测定217

7.4.9单个细胞核DNA的测定218

7.4.10线粒体质膜流动性的测定218

思考题219

参考文献220

附录RF-540荧光分光光度计的性能和操作方法220

第八章 原子吸收光谱分析技术221

8.1基本原理221

8.1.1原子吸收光谱的产生221

8.1.2原子谱线的轮廓与变宽222

8.1.3吸收定律224

8.2仪器结构225

8.2.1光源226

8.2.2原子化器226

8.2.3单色器227

8.2.4检测器和读出系统227

8.3分析方法228

8.3.1原子吸收光谱分析中的干扰及其消除228

8.3.2分析方法230

8.3.3灵敏度和检出限232

8.4实验233

8.4.1苹果中钙含量的测定233

8.4.2血清中镁含量的测定234

8.4.3头发中铅含量的测定235

8.4.4食用豆中微量元素铁、锰、锌含量的测定236

8.4.5食用豆中微量元素铜、镍含量的测定237

思考题238

参考文献239

附录1塞曼原子吸收法的主要吸收线和原子吸收相对灵敏度239

附录2日立180-80型偏振塞曼原子吸收分光光度计操作规程241

第九章 扫描显微分光光度法246

9.1显微分光光度法测定原理246

9.2显微光度计扫描测定的基本原理247

9.3扫描显微分光光度计的基本结构247

9.3.1显微镜248

9.3.2光度计248

9.3.3扫描系统249

9.3.4自动控制系统249

9.4显微光度法的应用实例250

9.4.1细胞容积的测定250

9.4.2剧烈运动前后细胞内酶的显微定量分析251

9.4.3染色体的核型分析253

9.4.4人染色体脆性位点的测定254

9.4.5染色体带纹的定量分析256

9.4.6核DNA的显微荧光定量分析261

9.4.7鱼三倍体DNA孚尔根测定方法262

9.4.8染色体DNA的显微荧光定量分析263

9.4.9毛纤维的荧光测定264

思考题264

参考文献265

附录Univar扫描显微分光光度计的性能及操作方法265

第十章 气相色谱技术267

10.1基本原理267

10.1.1概述267

10.1.2气相色谱的分析过程268

10.2气相色谱仪的基本结构269

10.2.1气相色谱填充柱269

10.2.2毛细管色谱柱271

10.2.3检测器272

10.3气相色谱分析方法274

10.3.1操作条件的选择274

10.3.2定性和定量方法275

10.4实验277

10.4.1食用豆类脂肪酸的气相色谱分离和测定277

10.4.2植物激素脱落酸的毛细管色谱分离和测定279

10.4.3微生物胞外多糖的毛细管色谱分离和测定281

10.4.4玉米螟昆虫激素的气相色谱分离和测定282

10.4.5酒精发酵液中乙醇含量的气相色谱分析283

10.4.6食用豆类碘的测定284

10.4.7丁醇的气相色谱分析286

10.4.8植物材料释放乙烯的气相色谱分离和测定288

思考题289

参考文献289

附录1岛津GC-7A气相色谱仪的操作方法289

附录2实验室常用固定液293

附录3不同温度下水的饱和蒸气压294

附录4不同进出口压力时的压力校正值j294

附录5标准筛的规格295

第十一章 高效液相色谱分离分析技术296

11.1概述296

11.2 HPLC的类型及其分离的基本原理296

11.2.1液-固色谱296

11.2.2液-液色谱和键合相色谱297

11.2.3离子交换色谱298

11.2.4排斥色谱（凝胶色谱）298

11.3高效液相色谱仪的结构299

11.3.1储液瓶299

11.3.2高压输液泵300

11.3.3进样系统300

11.3.4色谱柱301

11.3.5检测器301

11.4实验302

11.4.1单核苷酸的分离分析302

11.4.2可溶性糖的定量分析303

11.4.3氨基酸的分离分析技术304

思考题306

参考文献307

附录1岛津LC-4A高效液相色谱仪的结构与操作307

附录2氨基酸分析的预处理技术310

第十二章 薄层色谱扫描仪317

12.1仪器结构原理317

12.1.1测定原理317

12.1.2仪器结构318

12.2扫描方法321

12.3实验322

12.3.1线性扫描操作技术322

12.3.2锯齿扫描操作技术322

12.3.3微量核酸样品的定量分析323

12.3.4同功酶——多酚氧化酶的定量分析323

思考题324

参考文献325

附录1 CS- 910双波长薄层色谱扫描仪的性能与操作325

附录2 C-RIB的定量分析方法327

第十三章PCR技术329

13.1 PCR技术原理329

13.2 PCR的引物设计和DNA聚合酶331

13.2.1引物设计331

13.2.2 DNA聚合酶331

13.3 PCR扩增仪332

13.3.1加热与冷却系统332

13.3.2 PCR扩增仪的自动化332

13.3.3 PCR扩增仪示例——9700型PCR扩增仪333

13.4 PCR技术的应用及发展337

13.4.1双链DNA模板的 PCR扩增337

13.4.2 PCR扩增RNA338

13.4.3不对称PCR339

13.4.4原位聚合酶链式反应340

13.4.5长片段DNA的PCR技术341

13.4.6基因表达系列分析342

13.4.7有序差异显示法343

思考题345

参考文献345

第十四章 交变脉冲电场凝胶电泳346

14.1原理346

14.2交变脉冲电泳装置的类型346

14.2.1正交交变电场凝胶电泳346

14.2.2钳形均匀电场电泳347

14.2.3旋转凝胶电泳348

14.2.4倒转电场凝胶电泳348

14.3影响PFGE分离的因素348

14.3.1脉冲时间的影响348

14.3.2分子大小、电场强度和温度的影响348

14.3.3电场间角度的影响349

14.4分子陷阱349

14.5分子泳动的机制350

14.5.1常规电泳的分子机制350

14.5.2 FIGE分离过程的分子机制350

14.5.3分子在OFAGE中的重新定向机制350

14.5.4巨大分子的泳动351

14.6带宽和分辨率352

14.7脉冲电泳方法352

14.7.1样品制备352

14.7.2 DNA的标准品352

14.7.3电泳方法353

14.8应用实例353

14.8.1酵母染色体OFAGE的分离353

14.8.2棉病囊霉的电泳核型分析354

14.8.3小麦、大麦、黑麦大分子量DNA的脉冲电泳分离355

14.8.4水稻大分子DNA的脉冲电泳分离355

思考题356

参考文献356

第十五章 蛋白质组的研究技术357

15.1蛋白质组的分析流程357

15.2双向凝胶电泳358

15.2.1基本原理358

15.2.2仪器结构361

15.2.3具体操作362

15.3质谱技术377

15.3.1基本知识378

15.3.2仪器结构382

15.3.3应用实例383

思考题385

参考文献385

第十六章色谱工作站和影像系统386

16.1数据处理机和色谱工作站386

16.1.1概述386

16.1.2积分仪和色谱工作站的定量计算方法388

16.1.3色谱工作站390

16.2 CCD影像系统400

16.2.1影像系统的组成400

16.2.2 VDS影像分析摄录系统400

16.2.3图像定量分析原理402

16.2.4 Image Master软件功能404

思考题408

参考文献408