动物细胞培养 基本技术和特殊应用指南 原书第7版【2025|PDF下载-Epub版本|mobi电子书|kindle百度云盘下载】

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第1章 绪论1

1.1历史背景2

1.2组织培养的优点10

1.2.1环境控制10

1.2.2样品的特征和均一性11

1.2.3经济、规模和机械化11

1.2.4体内环境的体外模拟11

1.3局限性11

1.3.1专业技能11

1.3.2量的问题12

1.3.3去分化和选择12

1.3.4细胞的起源13

1.3.5不稳定性13

1.4体外的主要差异13

1.5组织培养的类型14

参考文献16

第2章 培养细胞的生物学21

2.1细胞培养环境21

2.2细胞黏附21

2.2.1细胞黏附分子22

2.2.2细胞间连接23

2.2.3细胞骨架24

2.2.4细胞外基质24

2.2.5细胞迁移25

2.3细胞增殖26

2.3.1细胞周期26

2.3.2细胞增殖调控27

2.4细胞分化27

2.4.1细胞分化的诱导和保持30

2.4.2细胞分化及去分化潜能31

2.5细胞信号转导32

2.6能量代谢34

2.7培养细胞的起源34

2.7.1培养的开始35

2.7.2细胞系的演化36

2.7.3细胞的衰老36

2.7.4连续细胞系的转化和建立36

2.8术语定义38

参考文献39

第3章 实验室设计及布局42

3.1布局、陈设和服务设施42

3.1.1必备条件44

3.1.2服务48

3.1.3通风装置48

3.2设计与布局49

3.2.1无菌操作区49

3.2.2层流柜50

3.2.3工作台50

3.2.4检疫和防范50

3.2.5培养51

3.2.6准备区54

3.2.7储存55

3.3灾害管理57

参考文献58

第4章 设备和材料59

4.1组织培养实验室的要求59

4.2无菌工作区61

4.2.1层流生物安全柜61

4.2.2手推车63

4.2.3无菌液体处理——移液和分液63

4.2.4倒置显微镜69

4.2.5照相机和监视器71

4.2.6解剖显微镜71

4.2.7离心机71

4.2.8细胞计数72

4.3孵育和培养73

4.3.1恒温箱73

4.3.2 湿式CO2培养箱73

4.3.3温度记录仪76

4.3.4滚筒支架76

4.3.5磁力搅拌器77

4.3.6培养器皿77

4.4准备和灭菌78

4.4.1洗涤78

4.4.2培养基和试剂的制备79

4.4.3灭菌80

4.5储存82

4.5.1耗材82

4.5.2冰箱和冷冻箱82

4.5.3冻存容器83

4.5.4程序降温仪83

4.6实验室辅助设备84

4.6.1计算机和网络84

4.6.2正置显微镜84

4.6.3低温冷冻箱84

4.6.4共聚焦显微镜85

4.6.5 PCR热循环仪85

4.7专用设备85

4.7.1显微注射装置85

4.7.2菌落计数器85

4.7.3离心式淘洗器85

4.7.4流式细胞仪86

参考文献86

第5章 无菌技术87

5.1无菌技术的目的87

5.1.1污染风险87

5.1.2维持无菌状态88

5.2无菌环境的基本要素89

5.2.1层流90

5.2.2安静区域91

5.2.3操作台92

5.2.4个人卫生93

5.2.5试剂和培养基94

5.2.6培养物94

5.3无菌处理94

5.3.1擦拭94

5.3.2加盖94

5.3.3灼烧95

5.3.4试剂瓶和培养瓶的操作95

5.3.5移液96

5.3.6大容量移液97

5.3.7液体倾倒97

5.4标准化操作97

5.4.1培养瓶和试剂瓶103

5.4.2培养皿和多孔培养板103

5.5仪器和设备104

5.5.1冰箱和冷室104

5.5.2恒温箱104

5.5.3盒装培养物106

5.5.4充入CO2气体106

参考文献107

第6章 安全性、生物伦理及验证108

6.1实验室安全108

6.2危险性评估108

6.3标准操作程序110

6.4安全规则110

6.5常规安全112

6.5.1操作者112

6.5.2设备113

6.5.3玻璃器皿和锐利物品113

6.5.4化学毒性114

6.5.5气体115

6.5.6液氮116

6.5.7烧伤116

6.6火116

6.7电离辐射117

6.7.1摄入117

6.7.2放射性废物的处理117

6.7.3标记试剂的辐照118

6.7.4高能源辐照118

6.8生物危害性118

6.8.1生物防范水平118

6.8.2生物安全柜（BSC）121

6.8.3人体活检材料123

6.8.4细胞系125

6.8.5遗传操作126

6.8.6生物危险性废物的处理126

6.8.7净化和熏蒸126

6.9生物伦理127

6.9.1动物组织127

6.9.2人体组织127

6.10质量保证129

6.10.1操作程序129

6.10.2质量控制（QC）129

6.10.3确认130

6.10.4身份验证130

6.10.5起源130

6.10.6污染131

参考文献131

第7章 培养器皿和附着物134

7.1附着物134

7.1.1附着和生长134

7.1.2常用的附着材料134

7.1.3附着物替代品135

7.2表面处理136

7.2.1附着物包被136

7.2.2饲养层138

7.2.3非黏性附着物139

7.3培养器皿的选择139

7.3.1细胞产量140

7.3.2多孔板141

7.3.3培养瓶和培养皿142

7.3.4高细胞产量143

7.3.5悬浮培养144

7.3.6通气144

7.3.7取样和分析145

7.3.8不均匀生长146

7.3.9成本146

7.4特殊系统147

7.4.1渗透性支持物147

7.4.2三维基质148

参考文献148

第8章 成分明确培养基及补充物151

8.1培养基的发展史151

8.2物理化学特征152

8.2.1 pH152

8.2.2 CO2和碳酸盐153

8.2.3缓冲作用155

8.2.4氧气155

8.2.5渗透压164

8.2.6温度165

8.2.7黏度166

8.2.8表面张力和成泡性166

8.3平衡盐溶液166

8.4完全培养基167

8.4.1氨基酸167

8.4.2维生素168

8.4.3盐类169

8.4.4葡萄糖169

8.4.5有机补充物169

8.4.6激素和生长因子169

8.4.7抗生素170

8.5血清170

8.5.1蛋白质172

8.5.2生长因子172

8.5.3激素173

8.5.4营养物及代谢物173

8.5.5脂类173

8.5.6矿物质173

8.5.7抑制物173

8.6培养基和血清的选择174

8.6.1血清批次预约176

8.6.2血清的测试176

8.6.3热灭活177

8.7其他添加物177

8.7.1氨基酸水解物177

8.7.2胚胎浸出液177

8.7.3适应性培养基177

8.8储存178

参考文献178

第9章 无血清培养基181

9.1血清的缺点189

9.2无血清培养基的优点190

9.3无血清培养基的缺点190

9.4血清的替代191

9.4.1无血清培养基的商业供应191

9.4.2血清替代物191

9.4.3无血清传代培养193

9.4.4激素193

9.4.5生长因子194

9.4.6血清中的营养物质194

9.4.7蛋白质和多聚胺199

9.4.8黏度199

9.5无血清培养基的研发199

9.6无血清培养基的选择200

9.6.1细胞或产物特异性200

9.6.2细胞系对无血清培养基的适应性200

9.7无血清培养基的制备204

9.8无动物蛋白培养基204

9.9小结204

参考文献205

第10章 准备与灭菌209

10.1准备试剂与用品209

10.2设备与液体的灭菌209

10.2.1干热灭菌210

10.2.2压力-蒸汽灭菌210

10.2.3射线灭菌211

10.2.4化学灭菌211

10.2.5无菌指示器211

10.2.6过滤灭菌212

10.3设备214

10.3.1玻璃器皿214

10.3.2玻璃移液管217

10.3.3螺口盖219

10.3.4清洁剂的选择222

10.3.5种类繁杂的设备222

10.3.6可重复使用的灭菌过滤器224

10.4试剂与培养基225

10.4.1水226

10.4.2纯水器的维护228

10.4.3平衡盐溶液228

10.4.4培养基的配制与灭菌230

10.5培养基的灭菌235

10.5.1可高压灭菌的培养基235

10.5.2除菌过滤235

10.5.3血清244

10.5.4其他试剂的准备与灭菌244

10.6培养基的质控、检测和储存244

10.6.1质量控制244

10.6.2无菌检测245

10.6.3培养基和血清的培养检测245

10.6.4储存251

参考文献252

第11章 原代培养253

11.1原代培养入门253

11.1.1用于解离组织的蛋白酶253

11.1.2解离过程的共同特点255

11.2组织分离256

11.2.1小鼠胚胎256

11.2.2鸡胚260

11.2.3人体活检材料261

11.3原代培养的类型263

11.3.1原代外植263

11.3.2酶的解离作用266

11.3.3温胰蛋白酶消化267

11.3.4低温预处理的胰蛋白酶消化270

11.3.5鸡胚器官原基273

11.3.6其他酶解过程277

11.3.7胶原酶277

11.3.8机械法解离279

11.3.9分离活细胞281

11.3.10原代培养小结283

11.3.11原始记录283

参考文献284

第12章 传代培养和细胞系286

12.1术语定义286

12.2传代培养和扩增286

12.2.1交叉污染和鉴定错误289

12.2.2支原体污染289

12.2.3细胞系的命名290

12.2.4培养物的年龄290

12.2.5有限细胞系和连续细胞系291

12.3选择细胞系291

12.4常规培养292

12.4.1细胞形态的意义292

12.4.2培养基的更换294

12.4.3标准的换液方案294

12.5传代296

12.5.1传代标准297

12.5.2单层生长细胞典型的传代方案299

12.5.3生长周期和传代比率303

12.5.4悬浮培养细胞的扩增307

12.5.5悬浮生长细胞的传代309

12.5.6培养条件的标准化311

12.5.7抗生素的使用311

12.5.8培养记录312

参考文献314

第13章 身份认证和验证316

13.1细胞系的身份认证316

13.1.1错误身份认定和交叉污染316

13.1.2错误身份认定和交叉污染的原因320

13.1.3避免错误身份认定和交叉污染321

13.1.4细胞系身份认证的技术321

13.1.5 DNA绘谱322

13.1.6通过DNA条码测定动物细胞的种属330

13.1.7同工酶分析336

13.1.8染色体含量341

13.1.9染色体显带技术344

13.1.10染色体分析345

13.1.11身份认证的必要性345

13.2细胞身份的验证346

13.2.1细胞的身世记录347

13.2.2微生物污染347

13.2.3步骤347

13.3质量保证348

13.3.1细胞系348

13.3.2培养基和试剂348

13.3.3培养器皿348

13.3.4仪器348

13.3.5设施349

参考文献349

第14章 污染352

14.1污染的来源352

14.1.1操作者的技术355

14.1.2环境355

14.1.3生物安全柜的使用和维护356

14.1.4湿度恒温箱356

14.1.5冷藏库357

14.1.6无菌材料357

14.1.7引入的细胞系和活组织357

14.1.8隔离357

14.2微生物污染的种类357

14.3污染物的监控358

14.3.1可见的微生物污染358

14.3.2支原体360

14.3.3支原体的荧光染色361

14.3.4 PCR法检测支原体365

14.3.5检测支原体的替代方法366

14.3.6支原体检测服务367

14.3.7病毒污染367

14.4污染培养物的处理368

14.5污染的去除368

14.5.1细菌、真菌和酵母菌368

14.5.2支原体的消除369

14.5.3清除病毒污染371

14.5.4顽固污染371

14.6交叉污染372

14.7结论372

参考文献372

第15章 冻存和建库374

15.1冻存的意义374

15.2冻存前的注意事项374

15.2.1鉴定375

15.2.2何时冻存375

15.3冻存细则375

15.3.1细胞冻存的理论背景375

15.3.2细胞浓度376

15.3.3冻存液376

15.3.4冷却速度377

15.3.5冻存管380

15.3.6低温冰箱381

15.3.7培养细胞的冻存385

15.3.8冻存记录387

15.3.9冻存管的解冻388

15.3.10培养瓶冻存391

15.3.11玻璃化保存391

15.4冻存库的设计和监控392

15.4.1库存管理、分配和使用393

15.4.2细胞库存的连续更换394

15.5细胞库394

15.6细胞的运输395

15.6.1冻存管396

15.6.2活细胞397

参考文献398

第16章 克隆培养及筛选400

16.1细胞的克隆培养400

16.2贴壁率的刺激404

16.2.1促进克隆生长的条件405

16.2.2条件培养基406

16.2.3饲养层细胞407

16.3悬浮克隆培养409

16.4细胞克隆的分离414

16.4.1单层贴壁细胞克隆的其他分离技术416

16.4.2悬浮细胞克隆417

16.5复制性培养418

16.6选择性培养基和抑制剂418

16.7细胞与基质的相互作用420

16.7.1选择性黏附420

16.7.2选择性脱壁420

16.7.3基质性质420

16.7.4选择性饲养层421

16.7.5半固体培养基选择421

参考文献422

第17章 细胞分选425

17.1细胞密度及等密度沉降法425

17.2细胞体积与沉降速率429

17.2.1单位重力沉降429

17.2.2离心淘洗分离技术429

17.3以抗体为基础的分选技术431

17.3.1免疫磁珠分选431

17.3.2荧光活化的细胞分选法434

17.4初试细胞分离者的选择435

参考文献435

第18章 细胞系鉴定437

18.1鉴定的需求437

18.2基因型鉴定437

18.2.1真实性验证438

18.2.2种属鉴定438

18.2.3转化438

18.3表型鉴定438

18.3.1谱系或组织标记438

18.3.2独特标记物441

18.4细胞形态学441

18.4.1显微镜446

18.4.2染色447

18.4.3细胞学检查所用培养器皿：单层培养449

18.4.4悬浮细胞细胞学检查的标本制备450

18.4.5光学显微照相技术451

18.4.6活细胞成像453

18.4.7共聚焦显微镜453

18.5抗原标记453

18.5.1免疫染色455

18.5.2免疫分析456

18.6间隔性记录457

18.7细胞周期459

18.7.1细胞分离459

18.7.2阻断459

参考文献460

第19章 分化462

19.1体内表型的表达462

19.1.1去分化463

19.1.2细胞谱系选择463

19.2分化阶段463

19.3增殖和分化464

19.4定向和细胞谱系464

19.5干细胞可塑性465

19.6分化标记物466

19.7诱导分化467

19.7.1细胞相互作用467

19.7.2全身性因子469

19.7.3细胞-基质相互作用472

19.7.4极性和细胞形状473

19.7.5动态应激474

19.7.6氧张力474

19.8分化和恶性474

19.9应用474

参考文献475

第20章 三维培养481

20.1细胞的相互作用和表型表达481

20.1.1三维培养的优点和局限性482

20.1.2模型的选择483

20.2器官培养487

20.2.1气体和营养物质的交换487

20.2.2结构的完整性488

20.2.3生长与分化488

20.2.4器官培养的局限性489

20.2.5器官培养的类型489

20.3组织型培养491

20.3.1凝胶和海绵技术491

20.3.2中空纤维492

20.3.3细胞球体492

20.3.4悬滴培养495

20.3.5微载体496

20.3.6类器官496

20.3.7转动室系统497

20.3.8藻酸盐活细胞固定术498

20.3.9滤膜小皿插件498

20.3.10神经聚集物的培养501

20.4器官型培养503

20.4.1组织等同物503

20.4.2组织工程503

20.5三维构建物中细胞的成像505

参考文献505

第21章 规模与自动化510

21.1规模悬浮培养510

21.1.1连续和分批培养513

21.1.2一次性生物反应器514

21.1.3规模和复杂性514

21.1.4搅匀和换气514

21.2单层规模培养519

21.2.1多表面扩增器520

21.2.2旋转培养523

21.2.3微载体526

21.2.4巨型微载体529

21.2.5灌流式单层培养530

21.3程序控制530

21.4大规模培养程序532

21.5自动化535

21.5.1机器人培养细胞536

21.5.2高通量筛选（HTS）537

21.5.3三维高通量筛选537

参考文献540

第22章 衰老，永生化和转化542

22.1在细胞系特征描述中的作用543

22.2遗传不稳定性和异质性544

22.2.1遗传不稳定性544

22.2.2染色体畸变545

22.3永生化545

22.3.1衰老的控制546

22.3.2病毒基因致永生化547

22.3.3人成纤维细胞的永生化550

22.3.4端粒酶诱导的永生化554

22.3.5供选择的永生化策略558

22.4生长控制异常559

22.4.1停泊不依赖性559

22.4.2接触抑制560

22.4.3血清依赖562

22.4.4癌基因562

22.5致瘤性563

22.5.1恶性化563

22.5.2肿瘤移植563

22.5.3侵袭力564

22.5.4血管发生565

22.5.5纤溶酶原活化因子568

参考文献569

第23章 定量574

23.1细胞计数574

23.1.1血细胞计数器575

23.1.2电子计数579

23.1.3染色的单层细胞583

23.1.4流式细胞仪584

23.2细胞重量和细胞压积585

23.3 DNA含量586

23.4蛋白质586

23.5合成速率586

23.5.1 DNA合成586

23.5.2蛋白质合成586

23.6准备样品用于酶分析和免疫分析587

23.7细胞计数587

23.7.1原位标记587

23.7.2流式细胞术587

23.8重复取样587

23.8.1数据获得588

23.8.2数据分析588

23.9细胞增殖589

23.9.1实验设计590

23.9.2生长周期590

23.9.3单层细胞生长曲线的分析593

23.9.4培养基体积、细胞浓度和细胞密度595

23.9.5悬浮培养597

23.9.6生长周期的各个阶段598

23.9.7生长曲线的衍生物599

23.10贴壁效率600

23.10.1集落形成分析602

23.10.2自动集落计数603

23.11标记指数604

23.11.1生长分数604

23.11.2有丝分裂指数605

23.11.3分裂指数605

23.12放射自显影术606

23.13细胞周期时间607

23.14细胞迁移608

参考文献608

第24章 细胞毒性610

24.1活性、毒性和存活610

24.2体外局限性611

24.2.1药物代谢动力学611

24.2.2新陈代谢611

24.2.3组织和全身反应612

24.3分析方法的类型612

24.3.1生存力612

24.3.2存活615

24.3.3细胞增殖测定620

24.3.4代谢性细胞毒性测定620

24.3.5微滴定实验620

24.3.6微滴定与克隆存活的比较625

24.3.7药物的相互作用625

24.4细胞毒性实验的应用626

24.4.1抗癌药物筛选626

24.4.2肿瘤药物的前瞻性实验626

24.4.3药物学实验627

24.5基因毒性627

24.5.1姐妹染色单体交换的诱变实验627

24.5.2致癌性627

24.6炎症反应628

参考文献629

第25章 特殊类型细胞的培养632

25.1特殊细胞培养技术635

25.2上皮细胞635

25.2.1表皮636

25.2.2角膜637

25.2.3乳腺637

25.2.4子宫颈637

25.2.5胃肠道638

25.2.6肝638

25.2.7人肝细胞系HepaRG639

25.2.8胰640

25.2.9气管和支气管上皮640

25.2.10口腔上皮640

25.2.11前列腺640

25.3间充质细胞640

25.3.1结缔组织641

25.3.2 脂肪组织641

25.3.3肌641

25.3.4软骨642

25.3.5骨643

25.3.6内皮细胞643

25.4神经外胚层细胞643

25.4.1神经细胞643

25.4.2神经胶质细胞644

25.4.3内分泌细胞646

25.4.4黑素细胞646

25.5造血细胞647

25.5.1红细胞647

25.5.2髓细胞和巨噬细胞647

25.5.3淋巴细胞648

25.6单克隆抗体的制备648

25.7生殖腺650

25.7.1卵巢650

25.7.2睾丸650

25.8冷血动物细胞的培养650

25.8.1鱼细胞651

25.8.2昆虫细胞651

25.9肿瘤细胞培养651

25.10取材652

25.10.1代表性细胞的选择652

25.10.2组织的冷冻保存653

25.11分离653

25.12原代培养654

25.13肿瘤细胞的选择培养655

25.13.1选择培养基655

25.13.2汇合饲养层655

25.13.3悬浮克隆658

25.13.4异种移植658

25.14细胞系的建立659

25.14.1原代肿瘤培养物的传代659

25.14.2连续细胞系659

25.15肿瘤细胞培养物的特征660

25.15.1肿瘤细胞的异质性660

25.15.2组织型培养661

25.16特殊类型肿瘤661

25.16.1乳腺661

25.16.2肺662

25.16.3胃663

25.16.4结肠663

25.16.5胰腺664

25.16.6卵巢664

25.16.7前列腺664

25.16.8膀胱665

25.16.9皮肤665

25.16.10子宫颈666

25.16.11胶质细胞瘤666

25.16.12神经母细胞瘤667

25.16.13精原细胞瘤667

25.16.14淋巴瘤和白血病667

参考文献667

第26章 干细胞677

26.1胚胎干细胞677

26.1.1小鼠胚胎干细胞的诱导677

26.1.2小鼠胚胎干细胞的传代培养和扩增677

26.1.3人胚胎干细胞的原代培养678

26.1.4鱼胚胎来源的多能干细胞680

26.2生殖细胞680

26.3胚外细胞680

26.3.1羊水细胞的培养680

26.3.2从新生儿或青年来源的细胞680

26.3.3成人来源的多能干细胞680

26.3.4人骨髓来源间充质干细胞681

26.3.5前列腺上皮干细胞681

26.3.6牙上皮干细胞681

26.3.7诱导多潜能干细胞682

26.4造血干细胞683

26.4.1小鼠骨髓长期培养686

26.4.2人骨髓长期培养686

26.5再生医学中干细胞的应用687

26.6肿瘤干细胞690

参考文献691

第27章 培训纲要697

27.1目的697

27.2实验制备及操作技巧699

27.3基本的细胞培养技术711

27.4高阶练习734

27.5特殊练习749

参考文献749

第28章 问题与对策750

28.1细胞异常形态750

28.2细胞生长缓慢751

28.2.1仅限于自己细胞出了问题751

28.2.2其他人也遇到同样的问题751

28.3培养基752

28.3.1试剂配方、准备和存储752

28.3.2不稳定试剂754

28.3.3配制培养基各种成分的纯度754

28.4基质和容器755

28.5微生物污染755

28.5.1仅限于单个实验者的问题755

28.5.2普遍问题756

28.5.3室内供气和层流净化工作台757

28.5.4特定污染758

28.6化学污染758

28.6.1玻璃器皿758

28.6.2移液管759

28.6.3水的纯化759

28.6.4低温冻存759

28.6.5粉末或气溶胶759

28.7原代培养759

28.7.1原代培养的存活率低759

28.7.2选择细胞错误761

28.7.3污染761

28.8分化761

28.9饲养762

28.9.1常规单层培养762

28.9.2克隆培养762

28.10传代762

28.10.1收获率低或生长缓慢762

28.10.2生长不均匀763

28.11克隆764

28.11.1培养皿形成的克隆数过低764

28.11.2培养皿形成的克隆数太多765

28.11.3非随机分布765

28.12交叉污染和错误标记765

28.13冻存765

28.13.1复苏时存活率低765

28.13.2冻存后细胞形态发生变化766

28.13.3冻存细胞丢失767

28.14细胞计数767

28.14.1用血细胞计数板计数767

28.14.2使用阻抗法电子计数仪计数767

参考文献768

第29章 结语769

附录Ⅰ 计算配制及试剂制备770

参考文献787

附录Ⅱ 术语788

参考文献796

索引797