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第一章 绪论1

第一节 国内外细胞培养技术发展概述1

第二节 国内外细胞库现状概述4

第二章 动物细胞体外培养的基本理论8

第一节 体外培养动物细胞生物学8

一、体外培养细胞的特征8

（一）形态学特征9

1．贴附型9

2．悬浮型10

（二）遗传学特征11

1．核型变化11

2．永生化和恶变11

3．细胞性别12

（三）生长特征12

1．贴附并伸展13

2．接触抑制13

3．密度抑制13

二、体外培养动物细胞的生长与增殖14

（一）单个细胞的生长过程14

1．G1期14

2．S期14

3．G2期14

4．M期14

（二）细胞系的生长过程15

1．原代培养期16

2．传代培养期18

3．衰退期19

（三）每代细胞的生长过程19

1．潜伏期20

2．指数生长期20

3．停滞期21

4．衰亡期21

三、体内外细胞分化特点23

（一）体内外细胞的差异23

（二）培养细胞分化状态的变化23

（三）培养细胞的分化24

1．不适应24

2．脱分化或去分化25

第二节 影响动物细胞体外生长的因素26

一、组织和细胞供体年龄26

二、细胞生存条件和环境26

（一）无菌环境对细胞生长的影响26

（二）培养基成分对细胞生长的影响26

1．水27

2．氨基酸27

3．碳水化合物27

4．无机离子28

5．维生素29

6．有机酸31

7．有机补充物31

8．促生长因子及激素31

9．黏滞度32

10．抗生素32

（三）培养基的pH对细胞生长的影响33

（四）温度条件对细胞生长的影响33

1．生理温度范围33

2．高温的影响34

3．低温的影响35

4．渗透压35

5．气相环境35

6．贴附底物36

7．辐射38

8．超声波39

9．影响细胞生长的其他因素39

第三节 细胞系或细胞株的构建40

一、基本概念40

二、所建细胞系（株）的档案信息41

（一）培养细胞的来源41

（二）细胞生物学特性41

（三）培养条件和方法42

三、细胞系（株）的鉴定42

（一）细胞系鉴定的内容42

1．细胞系的纯度42

2．细胞学特征42

3．细胞系的稳定性42

4．微生物污染检查42

5．细胞系（株）交叉污染检查42

（二）细胞系鉴定的方法43

1．形态学鉴定43

2．细胞核型分析43

3．细胞DNA指纹技术检测43

4．同工酶检测44

5．抗原标记44

6．细胞生长实验45

（三）细胞系鉴定的结论45

1．组织来源45

2．培养条件及方法45

3．染色体核型分析鉴定45

4．细胞生长情况45

5．细胞生物学检测46

6．细胞的冻存与复苏46

7．细胞有无交叉污染46

8．细胞系有无微生物污染46

四、细胞系的命名46

第三章 动物细胞体外培养的设施和基本条件47

第一节 实验室设计47

一、设计原则47

二、设计方案47

第二节 实验室布局48

一、无菌操作室48

二、清洗准备区49

（一）洗涤区49

（二）灭菌区49

（三）储藏区50

（四）试剂配制区50

三、低温储存区50

第三节 实验室设备器材50

一、必需设备51

（一）超净工作台51

（二）培养箱52

（三）倒置显微镜53

（四）高压蒸汽灭菌装置53

（五）电热干燥箱54

（六）水纯化装置54

1．金属蒸馏器具54

2．石英玻璃蒸馏器54

3．去离子水纯化装置55

4．超纯水装置56

（七）离心机56

（八）冰箱56

（九）天平56

（十）冷冻储存装置57

（十一）过滤除菌装置58

1．不锈钢板式滤器58

2．玻璃漏斗式滤器59

3．微孔滤膜滤器59

（十二）洗刷装置60

（十三）恒温水浴锅60

（十四）细胞计数板61

二、辅助设备61

（一）移液装置61

1．电动移液器61

2．微量移液器61

3．多通道可调式微量移液器62

4．连续加液装置62

（二）电子细胞计数仪62

（三）pH计63

（四）显微操作仪63

（五）细胞融合仪63

（六）磁力搅拌器64

三、常用耗材64

（一）手术器械64

（二）培养器皿64

1．溶液瓶65

2．培养瓶65

3．培养皿65

4．多孔培养板66

5．移液管和吸管66

6．离心管66

7．其他器皿66

（三）注射器和针头66

（四）滤膜66

第四章 动物细胞体外培养用液67

第一节 水和平衡盐溶液67

一、水67

二、平衡盐溶液67

（一）BSS液的类别68

1．配制培养液用BSS68

2．分散消化用BSS68

（二）BSS的制备68

第二节 培养基69

一、天然培养基69

（一）血浆70

（二）血清70

1．血清的种类70

2．血清的主要成分及主要作用71

3．细胞培养中使用血清的主要优点73

4．细胞培养中使用血清的缺点73

5．血清的质量标准75

6．牛血清产品的质量鉴定76

7．血清的使用与储存77

8．血清使用的注意事项77

（三）水解乳蛋白78

（四）胶原78

1．鼠尾胶原的制备方法79

2．胶原的使用方法79

（五）胚胎浸出液79

二、合成培养基80

（一）合成培养基的种类81

1．Eagle MEM85

2．DMEM85

3．IMDM85

4．RPMI 164086

5．199、109培养基86

6．HamF10、HamF1286

7．McCoy 5A86

（二）合成培养基的主要成分86

1．氨基酸87

2．维生素87

3．碳水化合物87

4．无机离子87

5．其他成分88

（三）合成培养液的配制88

（四）培养液的分类89

1．生长培养液89

2．维持液89

三、培养基和血清的选择89

（一）培养基的选择89

1．经验法90

2．实验法90

（二）对血清的选择90

1．血清批号差异和检测90

2．灭活问题91

四、无血清培养基91

（一）无血清培养液的特点92

1．无血清培养液的优点92

2．无血清培养液的缺点92

（二）无血清培养基的设计思路93

1．分析血清的成分93

2．采用合成的方法93

3．寻找限制因素93

（三）无血清培养基的组成成分93

1．基础培养基93

2．附加成分94

（四）无血清培养基的制备96

五、无蛋白培养基和限定化学成分培养基97

第三节 动物细胞体外培养的其他常用液98

一、其他常用液类型98

（一）消化液98

1．胰蛋白酶液98

2．胶原酶溶液98

3．EDTA溶液99

（二）pH调整液100

1．NaHCO3溶液100

2．HEPES溶液100

（三）抗生素液100

（四）冷冻保护剂101

（五）谷氨酰胺补充液102

二、几种常用液的具体配制102

（一）0.25％胰蛋白酶溶液102

（二）0.02％EDTA溶液102

（三）0.05％胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA·4Na溶液103

（四）5.6％NaHCO3溶液103

（五）1 mol/L HEPES缓冲液103

（六）青霉素／链霉素溶液（100倍浓度）103

（七）200 mmol/L谷氨酰氨液（100倍浓度）103

（八）冻存液103

第五章 培养器皿的清洗、消毒与灭菌106

第一节 清洗106

一、玻璃器皿的清洗106

（一）浸泡106

（二）刷洗107

（三）浸酸107

（四）冲洗107

二、塑料器皿的清洗108

三、橡胶制品的清洗109

四、金属器皿的清洗110

五、除菌滤器的清洗110

（一）玻璃漏斗滤器110

（二）蔡氏滤器110

（三）注射器薄膜滤器110

六、器皿包装111

第二节 消毒灭菌111

一、物理消毒灭菌方法112

（一）热力灭菌113

1．高温湿热灭菌113

2．高温干热灭菌115

（二）辐射灭菌法115

1．紫外线杀菌115

2．电离辐射灭菌116

3．微波灭菌116

（三）滤过除菌116

（四）超声波杀菌116

（五）干燥与低温抑菌117

二、化学消毒灭菌方法118

（一）化学消毒灭菌的机理118

1．使菌体蛋白变性、凝固118

2．破坏细菌的细胞膜118

3．干扰细菌的酶系统118

（二）化学消毒灭菌方法118

1．浸泡法118

2．擦拭法118

3．熏蒸法119

4．喷雾法119

（三）化学消毒剂的分类119

（四）细胞培养工作中常用的几种消毒灭菌剂121

1．苯扎溴铵（新洁尔灭）121

2．过氧乙酸121

3．戊二醛122

4．乙醇122

5．环氧乙烷123

6．二溴海因123

三、抗生素消毒灭菌124

四、影响消毒灭菌效果的因素124

（一）消毒剂量124

（二）微生物的种类和数量124

（三）温度125

（四）相对湿度125

（五）酸碱度125

（六）有机物质125

（七）拮抗物质125

第三节 清洁剂、消毒剂的选择126

一、清洁剂的选择126

二、消毒剂的选择126

（一）消毒剂的选择原则126

（二）消毒剂的选择126

第六章 实验室安全问题128

第一节 危险事故和防范128

一、人身危险129

（一）外伤129

（二）中毒129

（三）触电129

二、广泛性危险129

（一）火灾129

（二）有害物播散129

三、实验事故130

（一）仪器损坏130

（二）放射性物质130

1．摄入130

2．标记的试剂130

3．高能源130

（三）激光辐射131

（四）液氮131

（五）紫外光或紫外线131

（六）高压灭菌锅和微波炉131

（七）针剪器械131

（八）血液和血液制品132

（九）细菌菌株的运输有关事宜132

第二节 安全清单132

一、实验室建筑133

二、储存设施134

三、环境卫生和个人卫生设施134

四、暖气和通风134

五、照明135

六、保养135

七、安全135

八、消防135

九、易燃液体的储存136

十、电的危险136

十一、压缩气体和液化气136

十二、个体防护137

十三、实验室成员的健康与安全137

十四、实验室仪器设备138

十五、感染性物质138

十六、化学试剂和放射性物质138

第三节 危害性化学试剂139

一、化学试剂的毒性作用139

二、危害途径140

1．吸入140

2．接触140

3．食入140

4．外伤140

三、化学试剂的储存140

四、不能共存的化学试剂140

第七章 无菌技术147

第一节 无菌环境的维持147

一、工作环境147

二、工作台面148

三、试剂与培养基148

四、培养细胞所用器具149

五、个人卫生149

第二节 无菌操作的具体要求149

一、仪器和设备的无菌操作149

（一）培养箱149

（二）装取培养物150

（三）超净工作台150

二、超净工作台内的无菌操作151

（一）培养前的准备工作151

（二）用消毒液擦拭操作台151

（三）灼烧151

（四）试剂瓶和培养瓶的操作151

（五）移液151

（六）倾倒液体152

（七）加盖152

（八）培养皿和培养板的操作152

三、实例——在超净工作台内进行无菌操作添加培养基153

（一）实验材料153

（二）操作步骤153

第八章 家养动物细胞体外培养的基本方法155

第一节 家养动物细胞培养技术155

一、贴壁培养156

（一）基本原理156

（二）试剂和设备156

（三）操作步骤156

（四）说明157

（五）贴壁培养的讨论157

二、悬浮培养157

（一）操作步骤158

（二）悬浮培养的讨论158

第二节 取材与组织分离158

一、采样前的准备158

（一）准备工作158

1．实验室硬件的准备158

2．培养用液的准备159

3．清洗准备159

4．灭菌消毒准备159

5．采样器具的准备159

6．冻存细胞准备160

7．实验室消毒准备160

（二）准备步骤举例160

二、几类常用实验动物不同部位的取材161

（一）动物胚胎的取材161

1．分离鸡胚161

2．分离鼠胚162

（二）成体体表组织的取材163

（三）内脏器官组织的取材164

（四）血细胞的采集164

1．割（剪）尾采血164

2．鼠尾刺血法164

3．眼眶静脉丛采血165

4．断头取血165

5．心脏采血165

6．颈静脉采血165

7．腹主动脉采血165

8．股动（静）脉采血165

三、细胞培养的常用操作技术167

（一）细胞系的接种和传代167

1．悬浮培养细胞的接种和传代167

2．贴壁培养细胞的接种和传代168

（二）细胞的洗脱方法168

第三节 原代培养169

一、原代培养的类型169

（一）组织块原代培养法169

（二）悬浮细胞原代培养法171

（三）细胞的无血清培养172

（四）哺乳动物细胞的大量培养172

二、分离（散）细胞的方法173

（一）机械解离细胞法174

1．离心分离法174

2．切割分离法174

3．机械分散法174

（二）酶学解离细胞法174

1．胰蛋白酶解离细胞法175

2．胶原酶解离细胞法176

（三）螯合剂解离细胞法177

1．操作步骤177

2．讨论及注意事项178

3．培养结果179

三、原代细胞培养的注意事项179

（一）培养液179

1．培养基的选择179

2．添加物179

3．培养液的酸碱度179

4．换液180

（二）培养空间180

（三）其他方面180

第四节 传代培养181

一、传代过程181

（一）材料181

1．蛋白酶消化液181

2．蛋白酶抑制剂182

3．培养器皿182

4．培养液及平衡盐溶液182

（二）传代过程182

1．第一次传代182

2．常规传代183

二、传代培养的注意事项184

（一）传代的时机与再培养的细胞密度184

（二）传代数或代数与培养物的生长184

第五节 细胞的冻存、复苏与运输185

一、细胞的低温冻存185

（一）细胞冻存的步骤186

（二）细胞系的维持187

二、冻存细胞的复苏187

（一）用品188

（二）步骤188

（三）注意事项188

三、细胞培养物冻存和复苏中的安全措施188

四、细胞的运输189

第九章 家养动物组织细胞体外培养技术190

第一节 上皮组织的细胞培养190

一、内皮细胞的培养190

（一）血管内皮细胞的培养190

1．血管内皮细胞的分离191

2．血管内皮细胞的培养193

3．内皮细胞的传代、冻存与复苏193

4．血管内皮细胞的鉴定193

5．注意事项194

（二）淋巴管内皮细胞的培养195

1．灌注消化法195

2．植块培养法196

二、单层柱状上皮细胞的培养196

（一）胃黏膜上皮细胞的培养196

1．材料196

2．操作步骤197

3．结果分析197

4．胃黏膜上皮细胞的鉴定197

（二）肠黏膜上皮细胞的培养197

1．材料198

2．操作步骤198

3．结果分析198

4．肠黏膜上皮细胞的鉴定198

5．注意事项199

（三）子宫颈部上皮细胞培养199

1．材料199

2．操作步骤200

三、假复层纤毛柱状上皮细胞的培养201

（一）灌注消化法202

1．材料202

2．操作程序202

3．结果分析202

（二）组织块培养法202

1．材料202

2．操作程序203

3．结果分析203

（三）分化培养203

1．材料203

2．操作程序203

3．结果分析203

四、复层扁平上皮细胞的培养204

（一）表皮细胞的培养204

1．角质形成细胞的分离培养204

2．真皮复合培养法205

3．真皮替代物复合培养法205

4．角膜上皮细胞培养206

（二）食管黏膜上皮细胞的培养207

1．材料208

2．操作程序208

3．结果分析与鉴定208

4．注意事项208

（三）腺上皮细胞培养208

1．乳腺上皮细胞的培养209

2．从乳汁中获得乳腺上皮细胞的培养211

第二节 结缔组织的体外培养212

一、成纤维细胞的培养212

（一）动物真皮成纤维细胞的培养212

1．材料212

2．操作步骤212

3．培养结果及鉴定213

（二）鸡胚成纤维细胞的培养213

1．材料213

2．操作步骤214

二、巨噬细胞培养214

1．材料214

2．操作步骤215

3．结果与鉴定215

4．注意事项215

三、肥大细胞的培养216

（一）皮肤肥大细胞的培养216

1．材料216

2．操作程序216

3．结果与鉴定217

（二）肺肥大细胞的培养217

1．材料217

2．操作步骤217

3．结果分析218

（三）肠肥大细胞的培养218

1．材料218

2．操作程序218

3．结果分析219

四、前脂肪细胞的培养219

1．实验材料219

2．操作步骤220

3．实验结果与鉴定220

第三节 淋巴细胞的培养220

一、血细胞和淋巴细胞的发生和分类220

（一）血细胞的发生220

（二）血细胞的分类221

1．红细胞222

2．白细胞222

3．血小板223

（三）淋巴细胞的分类223

1．T淋巴细胞224

2．B淋巴细胞224

3．大颗粒淋巴细胞225

二、淋巴细胞的收集225

（一）淋巴液中淋巴细胞的收集225

1．实验材料225

2．操作步骤226

3．结果分析226

4．注意事项226

（二）淋巴结中淋巴细胞的收集226

1．实验材料227

2．操作步骤227

3．结果分析227

4．注意事项227

（三）血中淋巴细胞的收集227

1．实验材料228

2．操作步骤228

3．注意事项228

三、淋巴细胞的分离229

（一）淋巴细胞的纯化229

1．玻璃黏附法229

2．羰基铁粉法229

（二）T细胞和B细胞的分离230

1．尼龙毛柱分离法231

2．T细胞花环沉降法232

四、淋巴细胞的培养233

（一）淋巴细胞转化试验233

1．实验材料234

2．操作步骤234

3．结果分析235

4．讨论235

（二）淋巴细胞的体外长期培养235

1．用IL-2建立T淋巴细胞克隆235

2．EB病毒转化B淋巴细胞236

第四节 骨与软骨组织的体外培养237

一、成骨细胞的培养237

（一）骨内成骨细胞的培养237

1．实验材料237

2．操作步骤238

3．结果分析239

4．注意事项239

（二）骨膜内成骨细胞培养240

1．实验材料240

2．操作步骤240

3．结果与讨论240

二、破骨细胞的培养241

（一）成熟破骨细胞分离培养法241

1．实验材料241

2．操作步骤241

3．培养结果242

4．培养破骨细胞的鉴定242

5．讨论243

（二）骨髓长时间培养诱导分化形成破骨细胞法243

1．实验材料243

2．操作步骤243

3．结果与讨论244

三、软骨细胞的培养244

（一）关节软骨细胞的短期培养245

1．实验材料245

2．操作步骤245

3．结果分析246

4．讨论246

（二）关节软骨细胞的长期培养246

1．实验材料247

2．操作步骤247

3．结果分析247

4．注意事项248

四、滑膜细胞的培养248

（一）滑膜植块培养法248

1．实验材料248

2．操作步骤248

3．结果及鉴定249

（二）分离滑膜细胞培养法249

1．实验材料249

2．操作步骤249

3．细胞纯化250

4．结果讨论250

第五节 肌肉组织的体外培养250

一、骨骼肌细胞的体外培养251

（一）鸟类骨骼肌细胞的培养251

1．实验材料251

2．操作步骤252

3．结果分析252

4．注意事项252

（二）啮齿类动物骨骼肌细胞的培养253

1．实验材料253

2．操作步骤253

3．结果与讨论253

二、心肌细胞体外培养254

（一）实验材料254

1．来源254

2．手术器械254

3．清洗液254

4．消化液254

5．培养液254

（二）操作步骤255

（三）结果分析255

（四）注意事项255

三、平滑肌细胞的培养255

（一）实验材料256

（二）操作步骤256

1．分散细胞培养法256

2．植块培养法257

（三）结果分析257

（四）注意事项257

第六节 神经组织257

一、神经元的培养258

（一）实验材料258

1．来源258

2．手术器械258

3．盖玻片258

4．清洗液258

5．消化液258

6．培养液259

（二）操作步骤259

（三）结果鉴定259

（四）讨论259

1．取材259

2．培养条件260

3．操作过程260

4．关于神经元的纯度260

二、神经胶质细胞的培养260

（一）星形胶质细胞的培养261

1．实验材料261

2．操作步骤262

3．结果鉴定262

4．注意事项263

（二）少突胶质细胞的培养263

1．实验材料263

2．操作步骤263

3．结果鉴定264

4．注意事项264

（三）小胶质细胞的培养264

1．实验材料264

2．操作步骤265

3．结果鉴定265

（四）施旺细胞的培养265

1．实验材料265

2．操作步骤266

3．结果鉴定266

4．注意事项266

（五）黑色素细胞培养266

1．实验材料267

2．操作步骤267

3．结果鉴定267

第十章 干细胞的培养268

第一节 概述268

一、ES细胞的研究概况270

二、EG细胞的研究概况270

三、TS细胞的研究概况270

第二节 胚胎干细胞272

一、ES细胞的特性272

（一）全能性273

（二）种系传递性273

（三）遗传可操作性273

二、ES细胞的培养准备274

（一）分化抑制物的选择274

1．饲养层274

2．条件培养基275

3．分化抑制因子276

（二）培养基的设计277

1．基础培养基的选择277

2．添加物的选择277

三、ES细胞培养的方法与技术278

（一）早期胚胎的选择278

1．选择时间278

2．选择方法278

（二）早期胚胎的培养方法概述278

1．早期胚胎细胞培养279

2．胚胎与饲养层细胞共同培养279

3．ICM与饲养层细胞共同培养279

4．裸胚与饲养层细胞共同培养279

5．热休克处理胚胎与饲养层共同培养279

6．切割胚胎培养279

（三）ES细胞的分离与培养280

1．饲养层的制备281

2．ES细胞的培养284

四、ES细胞的鉴定290

（一）ES细胞的形态学观察290

（二）ES细胞的核型分析291

（三）ES细胞的分化潜能检测291

1．体外分化291

2．体内分化292

3．嵌合体实验292

4．Oct-4基因表达292

5．端粒酶活性检测292

6．克隆动物实验293

（四）特异性染色293

1．AKP染色293

2．免疫荧光标记294

五、ES细胞的诱导分化295

（一）基本原理295

（二）ES细胞体外诱导分化296

（三）ES细胞诱导分化的基本方法296

1．单层ES细胞培养和诱导分化296

2．ES细胞的EB形成和诱导分化296

（四）ES细胞诱导分化的几种细胞297

1．造血细胞297

2．内皮细胞与血管297

3．神经细胞298

4．心肌和其他肌肉细胞298

5．脂肪细胞298

6．软骨细胞299

7．胰岛细胞299

六、诱导分化细胞的永生化300

七、ES细胞制备嵌合体动物300

（一）胚胎聚合法301

（二）显微注射法301

八、几种动物ES细胞分离与克隆301

（一）牛ES细胞的分离与克隆301

1．试剂配制301

2．操作程序302

3．结果302

（二）小鼠ES细胞的分离与克隆303

1．试剂配制303

2．操作程序304

3．结果304

（三）猪ES细胞的分离与克隆305

1．试剂配制305

2．操作过程306

3．结果306

（四）猕猴ES细胞的分离与克隆307

1．试剂配制307

2．操作程序307

3．结果308

（五）羊ES细胞的分离与克隆308

1．试剂配制308

2．操作过程309

3．结果309

（六）兔ES细胞的分离与克隆310

1．试剂配制310

2．操作过程311

3．结果312

（七）鸡ES细胞的分离与克隆312

1．试剂配制312

2．操作过程313

3．结果313

九、ES细胞分离克隆的影响因素313

（一）遗传背景313

（二）胚龄314

（三）饲养层315

（四）培养基315

（五）生长、抑制因子316

（六）培养方式316

（七）其他因素316

十、ES培养及分化过程中常见的问题与对策316

（一）ES细胞培养与克隆316

1．ES细胞的死亡316

2．ES细胞的脱离317

3．ES细胞的分化317

（二）EB形成317

1．形成的EB数量少317

2．形成的EB数量差异大317

（三）造血分化过程中造血集落形成率低317

第三节 胚胎生殖细胞318

一、EG细胞培养的方法与技术318

（一）早期胚胎生殖腺的选择318

1．小鼠采用超排卵途径收集胚胎生殖腺318

2．人早期胚胎生殖腺的采集318

（二）早期胚胎的培养方法概述319

1．PGC与饲养层细胞共同培养法319

2．机械法319

（三）EG细胞的培养准备319

1．饲养层细胞的制备319

2．PGC的分离319

3．PGC的培养条件320

二、EG细胞的分离和培养320

（一）饲养层细胞320

（二）EG细胞的培养320

（三）EG细胞的纯化和建系321

（四）EG细胞的传代、冻存和复苏321

三、EG细胞的鉴定321

（一）EG细胞的形态学观察321

（二）EG细胞的分化潜能检测321

1．体外分化321

2．体内分化322

3．Oct-4基因表达322

4．嵌合体实验322

5．端粒酶322

（三）特异性染色322

1．AKP染色322

2．SSEA-1抗原322

四、EG细胞的诱导分化323

五、几种动物EG细胞的分离与克隆323

（一）牛EG细胞的分离与克隆323

1．试剂配制323

2．操作过程324

3．结果324

（二）猪EG细胞的分离与克隆325

1．试剂配制325

2．操作过程326

3．结果326

（三）鸡EG细胞的分离与克隆326

1．试剂配制326

2．操作过程327

3．结果328

六、EG细胞分离克隆的影响因素328

（一）遗传背景328

（二）PGC分离时期及分离、收集方法329

（三）饲养层329

（四）培养基329

（五）生长、抑制因子329

（六）其他因素330

七、EG细胞全能性发展前景330

（一）PGC向EG细胞转化330

（二）EG细胞与ES细胞的关系330

（三）PGC的应用前景331

第四节 造血干细胞331

一、HSC的特性332

（一）自我更新、自我维持的能力333

（二）分化能力333

二、HSC培养的方法与技术334

（一）HSC的来源334

1．骨髓334

2．外周血334

3．脐带血334

4．胎儿造血系统335

5．ES细胞和胚胎EG细胞分化335

（二）HSC的分离纯化原理336

（三）免疫磁珠阳性分选法337

1．材料337

2．试剂配制337

3．操作程序337

三、HSC的鉴定338

1．人粒单系集落形成单位（CFU-GM）的培养339

2．红系集落形成单位CFU-E和BFU-E培养340

3．CFU-Mega的培养341

四、HSC体外扩增与定向诱导分化342

五、HSC的细胞表型及其功能测定343

六、HSC的细胞周期的调控343

第五节 骨髓间充质干细胞344

一、MSC的特性345

二、MSC培养的方法与技术345

（一）密度梯度离心法345

1．试剂配制345

2．操作程序346

（二）流式细胞仪分离法346

1．试剂配制346

2．操作程序346

三、骨髓MSC鉴定347

（一）MSC的形态学观察347

（二）细胞组织化学特征347

（三）流式细胞学分析347

四、MSC的体外诱导分化348

（一）向成骨细胞分化348

1．试剂配制348

2．操作程序348

（二）向脂肪细胞分化348

1．试剂配制348

2．操作程序349

（三）向软骨细胞分化349

1．试剂配制349

2．操作程序349

第六节 神经干细胞350

一、NSC的特性350

（一）可塑性351

（二）自我更新、自我维持的能力352

二、NSC培养的方法与技术352

（一）胚胎NSC的培养352

1．材料352

2．试剂配制353

3．神经嵴细胞的培养354

4．培养物的鉴定及克隆培养354

5．结果355

（二）成年脑组织内NSC的培养355

1．材料355

2．试剂配制355

3．培养过程355

4．结果355

（三）小鼠脑室膜细胞源NSC的培养356

1．材料356

2．试剂配制356

3．操作程序356

（四）星形胶质细胞源NSC的培养357

1．材料357

2．试剂配制357

3．操作程序357

三、NSC的鉴定357

（一）细胞标志鉴定357

（二）功能鉴定358

四、NSC的诱导分化358

1．材料358

2．试剂配制358

3．操作程序358

五、神经培养的影响因素359

（一）胶质细胞培养物359

（二）培养基359

（三）分离时间359

（四）神经球的处理359

六、NSC分化的影响因素360

第七节 肝干细胞361

一、肝干细胞的特性361

（一）双潜能性361

（二）可塑性361

二、HOC及其分化361

三、肝干细胞的鉴定362

第八节 肌肉干细胞363

一、肌肉干细胞的特性363

二、成肌细胞的分离培养及鉴定364

1．材料364

2．试剂配制364

3．操作程序364

三、肌肉源间充质干细胞的分离培养及鉴定365

1．材料365

2．试剂配制365

3．操作程序365

第九节 表皮干细胞366

一、表皮干细胞的特性366

（一）标记物特异性366

（二）自我更新、自我维持的能力367

（三）分化潜能367

二、表皮干细胞的培养367

1．材料367

2．试剂配制367

3．操作程序367

三、表皮干细胞培养及分化中的问题368

第十节 胰岛干细胞368

一、PSC的特性369

（一）分化能力369

（二）特异分子标志369

二、小鼠PSC的培养369

（一）从小鼠胰腺导管制备PSC369

1．材料369

2．操作程序369

（二）从小鼠ES系定向诱导分化为PSC370

1．材料370

2．操作程序370

第十一章 肿瘤细胞的体外培养371

第一节 肿瘤细胞生长的细胞生物学特性372

一、肿瘤细胞的发生及判断概论372

二、肿瘤细胞在体外生长的生物学特性373

（一）生长分裂失去控制（永生性）373

（二）细胞形态学的变化373

（三）更高增殖力374

（四）非锚着生长依赖性375

（五）染色体数目及核型375

（六）异质性375

（七）具有接种致瘤性376

（八）细胞表面性状特点377

（九）接触抑制减弱或消失377

三、肿瘤细胞在体内和体外的生长特征差别377

（一）生长环境与营养供给377

（二）形态差异377

（三）生长环境377

（四）生长速度378

第二节 体外培养肿瘤组织细胞的方法和技术378

一、体外培养肿瘤细胞常用的培养基378

（一）培养基（液）的种类和选择378

（二）培养液特殊添加剂379

二、肿瘤组织细胞的原代培养379

（一）取材379

（二）培养方法380

1．植块培养380

2．分离（散）细胞培养380

3．原代培养的一般结果381

4．肿瘤细胞原代培养注意事项383

三、肿瘤细胞的传代培养383

四、肿瘤细胞的克隆培养法384

（一）集落克隆法384

1．不锈钢圈法385

2．滤纸法385

3．吸管吹打法385

（二）单个细胞克隆培养法386

1．有限稀释法386

2．毛细管分离法386

3．盖玻片法386

第三节 体外培养肿瘤细胞的生物学检测387

一、组织起源387

二、细胞形态观察387

三、细胞生长特征387

四、核型分析388

（一）获得中期分裂相细胞388

（二）收集分裂细胞388

（三）低渗处理388

（四）固定388

（五）制片388

（六）染色388

五、软琼脂培养388

1．琼脂制备389

2．将2×DME（含有2倍抗生素和20％CS）保存在37℃水浴中389

3．制备琼脂糖底层389

4．制备琼脂顶层389

5．上层琼脂凝固后，置37℃、5％CO2培养箱中培养10～14389

6．细胞集落389

六、异种移植法389

（一）宿主的选择389

（二）肿瘤细胞接种试验390

第四节 肿瘤细胞系的建立与保存390

一、肿瘤细胞的保存390

二、细胞系（株）建立过程中存在的问题390

第十二章 细胞培养过程中的污染的检测、消除和预防392

第一节 污染的种类和途径392

一、环境393

二、技术393

三、仪器设备和装置393

（一）超净工作台393

（二）潮湿培养箱393

（三）培养器皿及容器393

（四）冷冻储存394

四、材料和试剂394

（一）无菌材料394

（二）组织样本394

（三）血清394

（四）水394

（五）培养液、培养附加成分、试剂395

五、生物材料的传入395

第二节 污染对细胞的影响及检测395

一、微生物生长395

（一）细胞生长概述395

（二）群体生长396

（三）群体细胞生长周期397

1．延迟期397

2．指数生长期397

3．稳定期398

4．死亡期398

二、微生物污染398

（一）微生物污染的判断399

（二）微生物污染的观察399

（三）真菌污染及检测399

1．常用的真菌培养基400

2．样品的检查、接种和培养400

（四）细菌污染及检测401

1．常用的细菌培养基401

2．样品的检查、接种和培养402

（五）支原体污染及检测402

1．支原体对细胞的影响403

2．支原体污染的检测404

（六）病毒污染及检测409

1．常规检测409

2．反转录病毒的测定412

3．牛腹泻病毒的检测414

三、个体、种间交叉污染的检测415

（一）细胞交叉污染对细胞的影响415

（二）细胞交叉污染的判定415

1．细胞遗传学方法415

2．免疫学方法415

3．生化遗传学方法415

四、原生动物组织污染416

（一）原生动物污染416

（二）原生动物污染的检测416

1．溶液和原生动物培养基的制备416

2．接种到原生动物培养基上的培养细胞样品的制备418

3．用于Giemsa染色的培养细胞的制备418

第三节 污染的预防和消除419

一、微生物生长的控制419

（一）加热灭菌419

（二）辐射灭菌419

（三）过滤灭菌421

（四）化学物质对微生物生长的控制421

（五）生长因子类似物422

（六）抗生索422

（七）β-内酰胺类抗生素：青霉素和头孢霉素423

（八）由原核生物产生的抗生素424

（九）病毒的控制425

（十）真菌的控制426

（十一）抗生素抗性427

1．R质粒引起的抗性机制428

2．抗性质粒的来源428

3．抗生素抗性的传播429

4．克服抗药性的方法429

二、污染的预防430

（一）工作环境的无菌430

（二）器皿的灭菌431

（三）无菌技术431

（四）操作过程中污染的预防431

1．培养操作前的准备431

2．培养操作中的注意事项431

3．其他注意事项432

三、污染的消除432

（一）消除方法432

1．抗生素排除法432

2．加温除菌432

3．动物体内接种433

4．巨噬细胞吞噬法433

（二）确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤433

（三）针对某一种微生物污染的消除433

1．支原体的消除433

2．病毒污染的消除434

第十三章 家养动物体外培养细胞的生物学性状检测435

第一节 总论435

一、细胞体外培养的常规检查435

（一）细胞的一般形态435

（二）细胞增殖生长状态436

（三）培养液437

（四）微生物污染437

二、细胞生物学性状检测437

（一）形态学观察437

（二）细胞增殖生长观察438

（三）其他观察438

第二节 普通光学显微镜438

一、光学显微镜的成像原理、构造与性能438

（一）成像原理438

（二）构造438

1．机械部分439

2．照明部分439

3．光学部分440

（三）显微镜的性能440

1．数值孔径440

2．分辨力441

3．放大率441

4．焦深442

二、显微镜的使用方法442

（一）观察前的准备442

1．显微镜的放置442

2．调节光照442

3．调节光轴中心442

（二）低倍镜观察442

（三）高倍镜观察443

（四）油镜观察443

三、使用显微镜的注意事项443

第三节 特殊光学显微镜444

一、暗视野显微镜444

（一）概述444

（二）原理444

（三）操作步骤和注意事项445

1．操作步骤445

2．注意事项445

二、相差显微镜445

（一）概述445

（二）原理和结构特点446

1．原理446

2．结构特点446

（三）操作步骤和注意事项447

1．操作步骤447

2．注意事项447

三、荧光显微镜448

（一）概述448

（二）原理和结构特点448

1．原理448

2．结构特点449

（三）荧光显微镜的分类449

1．透射式荧光显微镜449

2．落射式荧光显微镜449

（四）操作步骤和注意事项450

1．操作步骤450

2．注意事项450

四、偏振光显微镜452

（一）概述452

（二）原理和结构特点452

1．原理452

2．结构特点452

（三）注意事项453

五、干涉显微镜453

（一）概述453

（二）原理和结构特点453

1．原理453

2．结构特点453

六、扫描隧道显微镜454

（一）概述454

（二）原理和结构特点455

1．原理455

2．结构特点455

七、原子力显微镜455

（一）概述455

（二）原理和结构特点455

1．原理455

2．结构特点456

八、视频显微镜457

（一）概述457

（二）原理和结构特点457

1．原理457

2．结构特点457

九、激光共聚焦扫描显微镜458

（一）概述458

（二）原理和结构特点458

1．原理458

2．结构特点459

第四节 电子显微镜术观察的一般过程459

一、透射电子显微镜460

（一）基本原理460

（二）制样技术461

1．超薄切片461

2．负染技术461

3．冰冻蚀刻461

（三）样品制备462

1．超薄切片法462

2．冷冻超薄切片法464

3．冷冻复型法465

（四）观察方法465

二、扫描电子显微镜466

（一）样品制备467

1．取材与清洗467

2．固定467

3．脱水467

4．干燥467

5．喷镀468

（二）观察方法468

三、超高压电子显微镜469

四、扫描式透射电子显微镜469

第五节 细胞的形态学观察469

一、培养细胞的形态分类469

（一）成纤维型细胞469

（二）上皮型细胞469

（三）游走型细胞470

二、培养细胞形态观察方法470

（一）直接观察法470

1．相差显微镜观察470

2．细胞生长状态的动态观察472

（二）固定观察法472

1．固定方法473

2．固定剂473

3．染色473

三、电子显微镜观察法474

（一）原理474

（二）方法474

1．透射观察法474

2．扫描观察475

第六节 细胞化学技术475

一、细胞的染色方法476

（一）培养细胞的活体染色方法476

1．贴壁细胞吉姆萨染色法476

2．悬浮细胞吉姆萨染色法476

3．台盼蓝染色法477

（二）细胞内糖类染色方法——过碘酸席夫反应法478

1．基本原理478

2．试剂配制478

3．染色步骤（以盖片培养法为例）479

4．结果479

（三）苏木精-伊红（HE）染色479

1．染液制备479

2．染色步骤（以盖片培养法为例）480

3．结果480

（四）细胞的脂类染色方法苏丹红Ⅲ染色法480

1．原理480

2．配制试剂480

3．染色步骤480

4．结果481

（五）细胞骨架的染色方法481

1．微丝的显示方法步骤481

2．微管的显示方法481

（六）富尔根反应显示DNA482

1．原理482

2．配制试剂482

3．染色步骤482

4．结果482

（七）甲基绿-哌咯宁法显示DNA和RNA482

1．原理482

2．配制试剂483

3．染色步骤483

4．结果483

（八）DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法483

1．原理483

2．材料483

3．染色步骤484

4．结果484

二、细胞内的酶的检测484

（一）酸性磷酸酶的检测484

1．原理484

2．作用液的配制485

3．染色步骤485

4．设立对照485

5．结果485

（二）葡萄糖-6-磷酸酶的检测485

1．作用液的配制486

2．染色程序486

3．设立对照486

4．结果486

（三）琥珀酸脱氢酶的检测486

1．配制作用液486

2．组织切片染色程序486

3．对照方法487

4．结果487

第七节 免疫细胞化学技术487

一、免疫细胞化学技术的概述487

（一）原理487

（二）免疫细胞化学技术的特点487

1．高度特异性487

2．敏感性高488

3．方法步骤统一488

4．形态、机能和代谢密切结合488

（三）免疫细胞化学的全过程488

（四）免疫细胞化学技术的研究进展488

二、细胞标本的制备和固定489

（一）细胞标本制备489

（二）细胞标本的固定489

1．物理固定489

2．化学固定489

（三）固定剂489

1．醛类固定剂490

2．非醛类固定剂491

3．丙酮及醇类固定剂491

（四）选择最佳固定液的标准492

（五）细胞固定的注意事项492

三、免疫细胞化学所需抗体的制备和配制492

（一）抗体的制备492

（二）抗体的配制493

1．抗体使用液的配制493

2．抗体稀释液的配制494

（三）抗体的储存与孵育494

1．一抗的储存494

2．一抗的孵育494

3．二抗的储存、稀释和孵育495

四、免疫细胞化学技术常用的标记物495

（一）辣根过氧化物酶495

1．底物DAB显色溶液的配制495

2．显色495

3．停止反应，用PBS冲洗，室温晾干保存496

4．注意事项496

（二）碱性磷酸酶496

1．快红（或快蓝）法496

2．新品红法496

（三）荧光素497

（四）胶体金与免疫金银技术497

1．胶体金的制备方法498

2．制备高质量胶体金的注意事项498

3．免疫胶体金制备499

4．免疫胶体金的应用500

5．免疫金及免疫金银技术的优点501

五、免疫染色程序501

（一）免疫细胞化学染色的典型程序501

1．免疫酶间接法501

2．免疫荧光LSAB法502

3．PAP法502

4．SPA-胶体金银法503

（二）在各种免疫染色中都必须注意的几个问题503

1．固定503

2．细胞表面抗原的免疫染色503

3．非特异性背景染色504

4．设立对照504

5．增强特异性染色的方法505

6．消除非特异性染色的方法506

7．显色反应的控制506

8．复染506

六、标记方法506

（一）免疫荧光技术507

1．直接法507

2．间接法507

3．标本保存及封片介质的制备508

（二）免疫酶细胞化学技术508

1．直接法509

2．间接法509

3．酶-抗酶方法510

4．双PAP法510

5．卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法511

6．标记的链霉卵白素-生物素法（LSAB）512

7．双染色技术512

七、免疫细胞化学结果的判断512

（一）阴性对照、阳性对照和吸收试验512

（二）特异性染色和非特异性染色的判断513

（三）阳性细胞的染色特征513

（四）染色失败的几种原因514

第八节 免疫荧光细胞化学技术514

一、免疫荧光细胞化学的原理515

（一）直接法515

1．检查抗原法515

2．检查抗体法515

（二）间接法515

1．检查抗体法515

2．夹心法516

3．检查抗原法双薄片法516

（三）补体法516

1．直接检查组织内免疫复合物法516

2．间接检查组织内抗原法516

（四）双重免疫荧光标记法516

（五）对照试验517

1．直接法517

2．间接法517

3．补体法517

二、荧光抗体的制备518

（一）荧光素518

1．异硫氰酸荧光素518

2．四乙基罗丹明518

3．四甲基异硫氰酸罗丹明520

（二）荧光素标记抗体的方法520

1．FITC标记抗体的方法520

2．四乙基罗丹明标记抗体的方法522

3．四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的方法523

4．藻红蛋白标记抗体的方法523

5．PE-标记蛋白A方法524

6．蓝色荧光素标记抗体的方法524

（三）荧光抗体质量控制524

1．染色特异性和敏感性的测定524

2．F/P比值的测定525

（四）荧光抗体的保存526

三、免疫荧光细胞化学染色方法526

（一）标本制作526

（二）荧光抗体染色方法526

1．直接法526

2．间接法527

3．补体法528

4．膜抗原荧光抗体染色法528

5．双重染色法528

6．荧光抗体再染色法529

（三）荧光抗原染色法529

第九节 细胞的增殖动力学检测529

一、活细胞的染料排除检测法529

（一）台盼蓝排除检测法529

1．2％台盼蓝溶液的配制529

2．染色与细胞计数530

（二）溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法530

1．EB或PI染液的配制530

2．荧光染色与计数530

（三）0.05％苯胺黑排除检测法530

（四）0.1％结晶紫排除检测法530

二、细胞计数530

（一）仪器、用品与试剂530

1．仪器与用品530

2．试剂531

3．材料531

（二）操作步骤531

三、细胞活力测定532

（一）细胞计数测定活力532

（二）四唑盐比色法测定活力532

1．试剂和器材532

2．操作步骤532

3．注意事项533

四、细胞的增殖动力学检测533

（一）细胞生长曲线533

1．培养细胞533

2．计数细胞密度533

3．绘制曲线533

（二）细胞周期的测定534

1．原理534

2．仪器、用品与试剂534

3．操作步骤534

（三）细胞分裂指数535

1．原理535

2．仪器、用品与试剂535

3．操作步骤535

4．注意事项535

（四）细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法536

掺入法……536 （五）细胞增殖能力分析试剂盒537

（六）荧光素发光法细胞生存能力检测试剂盒537

（七）接种存活率和克隆形成率537

1．细胞克隆形成率实验538

2．提高克隆形成率的方法540

3．细胞克隆技术541

第十节 流式细胞仪检测543

一、流式细胞仪的工作原理543

（一）参数测量原理543

（二）样品分选原理544

（三）数据处理原理545

1．数据显示545

2．数据分析545

二、流式细胞仪的基本结构546

（一）液流系统546

（二）光学系统547

（三）电子系统547

（四）资料存储和计算机控制系统548

（五）细胞分选系统549

三、用流式细胞仪检测的单细胞悬液的制备549

（一）贴壁培养细胞单细胞悬液的制备549

1．材料549

2．操作步骤549

（二）机械法制备新鲜实体组织的单细胞悬液550

1．材料550

2．操作步骤550

（三）石蜡包埋组织的单细胞悬液制备550

1．材料550

2．操作步骤551

四、流式细胞仪标本的制备551

（一）原理551

（二）试剂和器材551

（三）操作步骤551

（四）注意事项552

五、流式细胞仪的应用552

（一）DNA含量及细胞周期分析553

1．材料553

2．操作步骤553

（二）单个细胞细胞周期素的检测554

1．材料554

2．操作步骤554

3．方法评注555

（三）评估肿瘤细胞对化疗药物的耐药性555

1．材料555

2．操作步骤556

3．方法评注557

（四）单细胞内细胞因子产物的检测557

1．材料557

2．操作步骤558

3．方法评注559

4．注意事项559

（五）FCM在免疫表型分析上的应用560

（六）FCM用于定量分析560

（七）FCM用于细胞功能的分析560

（八）FCM用于细胞凋亡的研究561

（九）FCM在其他方面的应用561

第十一节 细胞毒性检测561

一、细胞毒性的评价指标561

（一）反映形态学改变的指标561

（二）反映细胞数量多少的指标561

（三）反映细胞膜完整性或通透性的指标561

（四）反映细胞亚细胞器损伤的指标562

（五）反映细胞代谢活性的指标562

二、细胞毒性检测方法562

（一）细胞毒性的形态观察方法562

1．倒置显微镜下直接观察细胞形态562

2．吉姆萨染色后观察细胞形态562

3．HE染色后观察细胞形态563

（二）细胞的数量检测564

1．细胞计数法564

2．四甲基偶氮唑盐微量酶反应显色法564

3．WST-1试验565

4．中性红试验566

5．结晶紫试验566

6．WST-1、中性红、结晶紫联合检测细胞毒性567

（三）细胞膜完整性或通透性检测567

1．台盼蓝拒染试验567

2．乳酸脱氢酶漏出率568

3．荧光染色法569

（四）细胞代谢活性的检测570

1．细胞中蛋白质含量测定570

2．细胞蛋白质合成测定571

3．细胞内还原型谷胱甘肽含量测定571

4．脂质过氧化产物生成量测定572

5．测定DNA合成的放射性同位素摄入法573

三、评价材料生物相容性的细胞毒性试验方法573

（一）间接法574

1．琼脂覆盖法574

2．分子滤过法574

3．甲基纤维素细胞培养法574

（二）直接法574

1．直接浸渍法575

2．直接接触法575

四、细胞毒性试验研究进展575

第十四章 家养动物细胞遗传学性状检测577

第一节 细胞的遗传学578

一、染色质与染色体578

（一）染色质的化学组成578

1．DNA578

2．组蛋白579

3．非组蛋白579

4．RNA580

（二）染色质的类型580

（三）染色质的基本结构单位580

（四）染色质的高级结构581

1．核小体581

2．螺线管581

3．超螺线管581

4．染色单体581

（五）染色体的形态与结构581

1．染色单体582

2．主缢痕582

3．着丝粒582

4．染色体臂583

5．次缢痕583

6．随体583

7．端粒583

二、细胞分裂过程中的染色体行为584

（一）有丝分裂584

（二）减数分裂584

1．减数分裂Ⅰ585

2．减数分裂Ⅱ585

三、染色体畸变585

（一）染色体异常585

（二）染色体畸变的原因586

第二节 性染色质检测586

一、原理586

二、方法587

（一）染色法显示X染色质587

1．碳酸复红法587

2．染色步骤587

3．结果587

（二）荧光染色显示Y染色质法587

1．荧光染液587

2．染色587

3．结果588

第三节 培养细胞染色体显示法588

一、制备染色体的原理588

（一）提高细胞分裂相数量588

1．刺激细胞增殖588

2．阻抑中期分裂相588

（二）促染色体分散措施589

1．低渗处理589

2．醋酸／甲醇固定589

二、外周血淋巴细胞染色体标本制备589

（一）用品与试剂589

（二）操作步骤589

1．培养液准备589

2．血细胞培养590

（三）注意事项590

三、羊水细胞培养591

（一）用品与试剂591

（二）操作步骤591

1．抽取羊水591

2．离心分离591

3．培养591

4．终止培养592

5．低渗、预固定、固定、制片、染色、观察、分析方法同外周血细胞染色体标本制备592

四、培养细胞染色体标本制备592

（一）用品与试剂592

（二）操作步骤592

1．加秋水仙素592

2．采集分裂细胞和离心592

3．低渗处理592

4．预固定592

5．固定592

6．制片593

（三）分析593

五、核型分析594

（一）仪器与材料594

（二）操作步骤595

第四节 染色体结构显示和检测596

一、染色体显带596

（一）染色体显带技术596

1．基于染料的染色体显带技术597

2．基于功能的显带技术599

3．染色体显带与荧光原位杂交技术599

4．减数分裂染色粒带型599

5．核酸酶显带技术600

6．抗体显带技术600

7．DNA杂交显带技术600

8．G11显带技术601

（二）常用染色体显带方法601

1．显C带法601

2．显Q带法602

3．显G带法603

4．显N带法604

二、姐妹染色单体区分染色法605

（一）原理605

（二）用品和试剂606

（三）操作步骤606

三、染色体脆性位点的检测606

四、微核检测607

（一）原理607

1．人末梢血淋巴细胞培养607

2．二倍体细胞607

3．动物骨髓细胞607

4．动物肝细胞608

5．人口腔上皮细胞608

6．植物细胞608

（二）用品和试剂608

（三）操作步骤608

1．细胞培养608

2．制片608

3．染色608

4．镜检及统计分析608

（四）注意事项609

五、非程序DNA合成检测609

（一）原理609

（二）用品和试剂610

1．培养的原代肝细胞，恒温水浴箱、冰箱、生物显微镜610

2．试剂610

（三）操作步骤610

1．细胞准备610

2．染毒与标记610

3．放射自显影处理611

4．细胞染色611

5．结果观察611

（四）结果与分析611

（五）注意事项612

第五节 细胞DNA遗传特征分析612

一、细胞DNA含量测定612

（一）用品和试剂612

（二）操作步骤613

二、细胞DNA合成测定613

（一）用品和试剂613

（二）操作步骤613

（三）注意事项614

第六节 染色体基因定位614

一、基因定位的方法615

（一）体细胞杂交法615

（二）原位杂交技术615

（三）连锁分析616

二、荧光标记原位杂交法616

（一）原理617

（二）材料618

（三）探针的制备、标记和鉴定618

1．质粒DNA的扩增、提取及纯化618

2．探针的标记618

3．探针的纯化618

4．探针的鉴定618

（四）荧光原位杂交619

1．杂交实验材料预处理619

2．杂交619

（五）检测619

1．杂交后洗涤619

2．直接标记荧